德國(guó)cellendes的3D細(xì)胞水凝膠系統(tǒng)是一套用于3D細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)構(gòu)建細(xì)胞外基質(zhì)組分的試劑。使用者可以利用這些試劑控制細(xì)胞外環(huán)境,設(shè)計(jì)適合細(xì)胞生存的3D系統(tǒng)。
3D細(xì)胞水凝膠系統(tǒng)與活體細(xì)胞外基質(zhì)相似,采用該系統(tǒng)可使體外細(xì)胞培養(yǎng)更接近體內(nèi)的生理特征,是基礎(chǔ)研究、藥物篩選和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域細(xì)胞功能研究的理想選擇。
一、使用cellendes 3D細(xì)胞水凝膠系統(tǒng)時(shí)的注意事項(xiàng):
1. 所有步驟均在無菌環(huán)境下操作。
2. 一般選擇使用10x CBpH 5.5,10x CBpH 5.5不適合時(shí),才會(huì)使用10x CBpH 7.2 。但是使用10x CBpH 7.2時(shí),凝膠形成的速度很快,降低CB的pH值,可以減緩凝膠形成的速度,可以混合10x CBpH 5.5和10x CBpH 7.2 。
CBpH 5.5和CBpH 7.2混合后CB的pH值(詳見說明書p10)
3. 細(xì)胞懸液: PBS或培養(yǎng)基懸液
4. Mal-PVA或Mal-Dextran溶解后冰浴上使用。溶解后應(yīng)放于-80℃保存,使用時(shí)避免反復(fù)凍融,如果短期內(nèi)使用,可以4℃放置(1周左右)
5. PEG-link和CD-link不要長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中
二、使用cellendes 3D細(xì)胞水凝膠系統(tǒng)時(shí)實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備:
1. 解凍、溶解3D水凝膠組分(詳見說明書),保證全部溶解
2. 如果3D水凝膠需添加RGD肽(詳見說明書):
A. 用水溶解RGD肽,使終濃度是3.0mmol/L
B. 如需比較RGD肽不同濃度的效果,會(huì)使用硫代甘油,需將硫代甘油:水=1:6.7溶解,使終濃度是3.0mmol/L
3. 保證Mal-PVA或Mal-Dextran 冰浴上
4. 準(zhǔn)備細(xì)胞懸液(PBS或培養(yǎng)液),建議細(xì)胞懸液濃度時(shí)2-4 x106/ml,使zui終濃度時(shí)10000-20000個(gè)細(xì)胞/30ul
三、無RGD肽時(shí)cellendes 3D細(xì)胞水凝膠系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)操作:
注:需保證馬來酰亞胺基團(tuán)(Mal- )和硫醇基團(tuán)(SH- )等量
可以預(yù)實(shí)驗(yàn)決定凝膠強(qiáng)度
注:CBpH5.5和細(xì)胞懸液的量是不變的,為了保證等滲條件
實(shí)驗(yàn)步驟如下:
A.按上表混合水、CBpH5.5、Mal-PVA(或Mal-Dextran)、細(xì)胞懸液于一管(管1)中
B.將PEG-link(或CD-link)滴加到培養(yǎng)皿表面
C. 用吸頭吸出管1中的組分,與培養(yǎng)皿上的PEG-link(或CD-link)混合,快速吹打3-4次
D. 避免產(chǎn)生氣泡,放置至少一分鐘(3-5min),等待凝膠形成
E. 一旦凝膠形成,輕輕加培養(yǎng)液至覆蓋住凝膠,蓋上培養(yǎng)皿蓋,至合適的溫度孵育
F. 兩個(gè)小時(shí)后更換新培養(yǎng)基
四、用RGD肽時(shí)cellendes 3D細(xì)胞水凝膠系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)操作:
一般情況下1mmol/l或低于1mmol/l的RGD肽,就可以提供足夠的粘附力
當(dāng)需比較RGD肽濃度以及是否需要使用RGD肽時(shí),需用到硫代甘油
下表中列舉的是:馬來酰亞胺基團(tuán)(Mal--)=硫醇基團(tuán)(SH--)=5mmol/l,選擇zui合適RGD肽濃度時(shí),需用硫代甘油來調(diào)節(jié)
如確定交聯(lián)強(qiáng)度是5mmol/l,可按下表預(yù)實(shí)驗(yàn)RGD肽濃度
實(shí)驗(yàn)步驟如下:
實(shí)驗(yàn)操作示意圖(30ul體系)
A. 按上表混合水、CBpH5.5、Mal-PVA(或Mal-Dextran)、細(xì)胞懸液于一管(管1)中
B. 添加RGD肽和硫代甘油于管1中,快速混勻,室溫放置5-10min,有足夠的時(shí)間使RGD peptide共價(jià)結(jié)合到馬來酰亞胺基團(tuán)(Mal- )上
C. 將PEG-link(或CD-link)滴加到培養(yǎng)皿表面
D. 將細(xì)胞懸液添加到管1中
E. 用吸頭吸出管1中的組分,與培養(yǎng)皿上的PEG-link(或CD-link)混合,快速吹打3-4次
F. 避免產(chǎn)生氣泡,放置至少一分鐘(3-5min),等待凝膠形成
G. 一旦凝膠形成,輕輕加培養(yǎng)液至覆蓋住凝膠,蓋上培養(yǎng)皿蓋,至合適的溫度孵育
H. 兩個(gè)小時(shí)后更換新培養(yǎng)基
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